iptg诱导蛋白表达

时间:2025-02-14 18:03:41 单机游戏

IPTG诱导蛋白表达的原理主要基于IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导物,能够与乳糖操纵子中的阻遏蛋白结合,导致阻遏蛋白构象变化并离开操纵基因,从而解除对RNA聚合酶的阻碍,启动目标基因的转录和翻译过程。

具体来说,IPTG的作用机制如下:

乳糖操纵子系统:

在乳糖操纵子系统中,没有乳糖时,阻遏蛋白(由操纵序列O编码)与操纵序列O结合,阻碍RNA聚合酶与启动序列P结合,从而抑制转录启动。当有乳糖存在时,乳糖被细胞利用,乳糖的代谢产物异乳糖可与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白构象变化,从操纵基因O上解离,从而启动转录。

T7 RNA聚合酶系统:

在一些实验室常用的蛋白表达系统中,例如大肠杆菌中的T7 RNA聚合酶系统,IPTG可以结合到T7 RNA聚合酶的结合位点上,与自然界存在的半乳糖苷类物质同样具有结合能力。当IPTG存在时,它结合到启动子上的结合位点上,抑制了启动子上的T7 RNA聚合酶的结合,从而阻断了目标基因的转录过程。

IPTG的诱导步骤通常包括:

构建原核表达质粒:

通过目的基因PCR、载体酶切、连接、转化、挑单克隆送测序等步骤,构建含有目标基因的原核表达质粒。

转化与培养:

将构建成功的质粒转化到合适的菌株中,进行培养。

小诱导摸索最佳诱导条件:

通过改变IPTG浓度、温度等条件,找到最适的诱导条件。

大规模诱导:

在找到最适诱导条件后,进行大规模诱导。

菌体收集与破碎:

取出诱导后的菌液,进行离心、收集菌体并破碎,以提取表达产物。

需要注意的是,尽管IPTG是一种普遍应用的诱导剂,但它也有一定的毒性,因此在制备医疗目的的重组蛋白时并不合适。此外,也有研究使用乳糖或其他替代物作为诱导物。