荧光定量PCR(qPCR)程序的设定主要包括以下几个步骤:
荧光阈值的设定
荧光阈值是指荧光信号达到其平均值的倍数,通常设为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
反应体系的配制
根据实验需求选择合适的荧光染料和淬灭基团,并设定标准品的浓度及稀释倍数。
热循环程序文件的设置
设置变性、退火和延伸的温度和时间。常见的变性温度为90-95℃,退火温度为40-60℃,延伸温度为70-75℃。
根据具体实验需求,可以选择三温度点法或二温度点法。
反应板文件的设置
选择使用的荧光染料种类,设置样品类型,包括标准品、实验组和对照组等。
实验设置
输入实验名称、仪器型号、实验目的(如定量、基因分型等),并选择定量类型(如标准曲线、相对标准曲线、相对定量)。
设置探针法或染料法,定义模板类型(如gDNA、cDNA),并添加目的基因和内参基因。
样本和反应孔的设置
根据样品的排布选择反应孔,并指定每个孔的基因和样本类型。
结果分析
PCR反应结束后,软件会自动计算标准曲线和Ct值,并进行表达量分析、等位基因分析等。
关闭运行仪器
实验结束后,取出反应管,关闭定量PCR仪和电脑。
通过以上步骤,可以完成荧光定量PCR程序的设定,并进行实验操作和结果分析。建议在实际实验中根据具体需求和仪器条件进行适当调整,以确保实验的准确性和可重复性。