设定PCR仪程序的一般步骤如下:
开机与预热
连接PCR检测仪器电源,确保电源稳定且接地良好。
打开仪器开关,等待仪器启动并进行自检。
进入程序设置
打开PCR检测仪器的操作界面,通常为液晶显示屏和按键或触摸屏操作。
在界面上找到程序设置选项,进入程序编辑模式。
设置PCR反应参数
变性温度:一般设定在90 - 98℃之间,常见的为95℃。此温度下,双链DNA会解链为单链,时间通常为15 - 30秒,具体根据模板和引物的特性调整。
退火温度:根据引物的Tm值(解链温度)来设定,一般在50 - 65℃范围内。退火温度影响引物与模板的结合效率,通常为30 - 60秒。
延伸温度:对于常见的Taq DNA聚合酶,延伸温度一般在70 - 75℃左右,时间根据扩增片段的长度而定,通常每1kb的片段延伸1分钟左右。
循环次数:根据样本中目标核酸的含量和检测灵敏度要求,一般设定在20 - 40次之间。循环次数过少可能导致扩增产物量不足,过多则可能增加非特异性扩增的风险。
其他参数设置
除了温度和时间参数外,还需设置反应体积等其他相关参数。确保输入的反应体积与实际反应体系的体积一致,以保证仪器的温度控制和加热均匀性。
保存程序
设置完成后,仔细核对各项参数是否正确,确认无误后保存程序。
建议
根据实验需求调整参数:不同的实验样品和引物可能需要不同的PCR程序参数,因此在设置程序时应根据具体情况进行调整。
多次预实验验证:在正式实验前,建议进行多次预实验,以验证PCR程序的有效性和可靠性。
参考文献和仪器说明书:在设置PCR程序时,可以参考相关文献和仪器说明书,确保参数设置的科学性和准确性。