数字PCR(Digital PCR,dPCR)是一种基于单分子核酸扩增和检测的技术,其基本原理如下:
样本分散:
将待测的核酸样本分散成数千到数百万个独立的微反应单元。这些微反应单元可以是微滴(如滴式dPCR)或微孔(如片式dPCR)。
单分子扩增:
每个微反应单元中包含一个或多个核酸分子(DNA模板)。这些模板在PCR扩增过程中被单独扩增,每个单元中的扩增产物数量理论上可以是单分子级别。
荧光信号检测:
扩增完成后,每个微反应单元中的荧光信号被检测。由于每个单元中的扩增产物数量是已知的,因此可以通过荧光信号的统计和计算来确定原始样本中目标核酸分子的数量。
绝对定量:
数字PCR不需要标准品或内标,可以直接对目标核酸分子进行绝对定量。通过检测每个单元中的荧光信号,可以推算出原始样本中目标分子的浓度。
高灵敏度和特异性:
由于每个微反应单元中的扩增是独立的,因此数字PCR具有极高的灵敏度和特异性。即使模板浓度很低,也能准确检测到单个分子的存在。
数字PCR的主要优势在于其高灵敏度和绝对定量能力,适用于罕见突变检测、基因表达分析、病原体检测等领域。与传统的实时荧光定量PCR(qPCR)相比,数字PCR在反应结束后一次性读取荧光信号,然后通过泊松分布计算模板量,从而避免了qPCR中因扩增效率不完全导致的定量误差。