PCR(聚合酶链式反应)扩增的程序通常包括以下三个主要步骤,这些步骤在一个循环中依次进行,并通过多次循环实现DNA片段的扩增:
变性
将DNA模板加热至94-98°C,以解开双链DNA,使其成为单链。这一步骤对于热启动PCR是必不可少的,并且时间取决于所使用的DNA聚合酶。
退火
将温度降低至55-65°C,使引物与单链DNA模板上的互补序列结合。引物通过互补配对定位到需要复制的目标序列的起始和终止位置。
延伸
将温度升至72°C,在DNA聚合酶的作用下,以dNTP为原料,合成一条新的与模板DNA链互补的子链。这个过程需要一定的温度和时间,以确保子链的合成是准确的。
一个典型的PCR循环包括以下具体步骤:
95℃变性30秒至1分钟(确保模板和引物完全分离)
55℃退火20至30秒(引物结合到模板)
72℃延伸30秒至1分钟(DNA聚合酶合成新链)
重复以上步骤20到35次,以确保足够数量的DNA片段被扩增。最后一个循环结束后,通常将反应管置于72°C温育5分钟,以确保充分延伸。
建议在实验过程中,根据具体的PCR仪和引物设计,适当调整温度和时间,以达到最佳的扩增效果。