RNA提取的步骤和原理如下:
组织裂开
使用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等试剂裂开组织,同时加入β-巯基乙醇(β-ME)以抑制RNA酶活性。
RNA分别
将裂解后的组织或细胞悬液与RNA提取试剂(如TRIzol)混合,使用涡旋振荡器充分裂解细胞结构,使RNA释放出来。
RNA沉淀
加入氯仿进行离心,氯仿的密度大于水,能将RNA从蛋白质和DNA中分离出来,RNA主要存在于上层水相。
RNA洗涤
使用70%乙醇洗涤RNA沉淀,以去除残留的氯仿和其他有机溶剂,同时去除RNA表面吸附的少量杂质。
RNA溶化
使用无RNA酶的水或TE缓冲液溶解RNA沉淀,得到纯净的总RNA。
RNA保存
将溶解后的RNA储存在-70°C或-80°C条件下,以防止降解。
RNA提取原理
RNA提取的原理主要基于以下几点:
细胞裂解:使用强力的蛋白质变性剂(如异硫氰酸胍)破坏细胞结构,释放细胞内的核酸和蛋白质,同时抑制RNA酶活性。
有机溶剂提取:利用氯仿的密度大于水,将RNA从蛋白质和DNA中分离出来,RNA主要存在于上层水相。
RNA沉淀:通过加入异丙醇使RNA脱水并产生沉淀,从而实现RNA的回收。
RNA洗涤:使用乙醇洗涤RNA沉淀,去除残留的有机溶剂和杂质。
注意事项
RNA提取过程中需要避免RNA被RNase降解,因此在整个过程中要采取多种措施防止RNase的污染。
样本处理要充分,研磨要彻底,以确保RNA的得率和质量。
离心时要控制好转速和时间,以确保RNA的有效分离和沉淀。
通过以上步骤和原理,可以有效地从生物样本中提取出高质量的RNA。